??①称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

　　??③弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,10g,4℃离心 10min。

　　??⑤在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或200W,超声 3 秒,间隔 10 秒,重复 30 次),用于线粒体 CS 测定。

　　??分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 412nm,蒸馏水调零。

　　??(1)在试剂五中加入 0.6mL 无水乙醇和 13mL 试剂四,混匀,37℃(哺乳动物)或 25℃(其

　　??(2)测定管:在 EP 管中加入 40μL 样本、880μL 试剂五和 40μL 试剂六,混匀,37℃反应 15min 后立即测定吸光值 A1。

　　??(3)计算 ΔA=A1-A2,每个测定管设一个对照管。

　　CS 活性计算:

　　??单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。CS(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=117.6×ΔA÷Cpr

　　??(4)按样本鲜重计算:

　　??CS(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=23.8×ΔA÷W(3)

　　??单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。CS(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.0475×ΔA V 反总:反应体系总体积,9.6×10-4 L;ε:TNB 摩尔消光系数,1.36×104 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.04 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。

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